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Apr 12, 2023

Nova máxima

O design inovador de digitalização a laser desbloqueia alta precisão

O design inovador de varredura a laser desbloqueia observações de alta precisão em até 10.000 quadros por segundo, tornando o microscópio uma poderosa ferramenta de registro

SPIE - Sociedade Internacional de Óptica e Fotônica

imagem: Ao combinar dois modos de varredura a laser, os pesquisadores desenvolveram um sistema versátil de microscopia de dois fótons que pode ser usado para observar processos biológicos extremamente rápidos em altas taxas de quadros e resolução espacial.Veja mais

Crédito: Li et al., doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

A microscopia de dois fótons (TPM) revolucionou o campo da biologia ao permitir que os pesquisadores observassem processos biológicos complexos em tecidos vivos em alta resolução. Em contraste com as técnicas tradicionais de microscopia de fluorescência, o TPM faz uso de fótons de baixa energia para excitar moléculas fluorescentes para observação. Isso, por sua vez, possibilita uma penetração muito mais profunda no tecido e garante que as moléculas fluorescentes, ou fluoróforos, não sejam permanentemente danificadas pelo laser de excitação.

No entanto, alguns processos biológicos são simplesmente rápidos demais para serem registrados, mesmo com TPMs de última geração. Um dos parâmetros de projeto que limita o desempenho de um TPM é a frequência de varredura de linha, medida em quadros por segundo (FPS). Isso se refere à taxa na qual a amostra alvo pode ser varrida pelo laser de excitação ao longo de uma direção (por exemplo, em uma varredura horizontal). Uma frequência de varredura lenta também afeta o FPS geral do sistema, pois determina a velocidade com que o laser pode ser varrido na outra direção, ou seja, em uma varredura vertical. Juntos, eles criam uma compensação entre a resolução temporal do microscópio e o tamanho do quadro de observação.

Trabalhando em torno deste problema, uma equipe internacional de pesquisadores da China e da Alemanha desenvolveu recentemente uma configuração de TPM poderosa com uma frequência de varredura de linha sem precedentes. De acordo com o relatório publicado na Neurophotonics, este sistema de microscopia foi projetado para gerar imagens de processos biológicos rápidos em alta resolução temporal e espacial.

Um dos principais fatores que distinguem o TPM proposto dos convencionais é o uso de defletores acústico-ópticos (AODs) para controlar a varredura do laser de excitação. Um AOD é um tipo especial de cristal cujo índice de refração pode ser controlado com precisão por ondas acústicas. Isso, por sua vez, nos permite redirecionar um feixe de laser conforme desejado. Mais importante ainda, os AODs permitem um direcionamento a laser mais rápido do que o obtido com os galvanômetros usados ​​nos TPMs convencionais.

Assim, a equipe projetou um AOD personalizado com uma velocidade acústica excepcionalmente alta usando um cristal de dióxido de telúrio (TeO2), alcançando uma alta frequência de varredura de linha. Com este AOD, o laser pode varrer uma linha no quadro em apenas 2,5 microssegundos, correspondendo a uma frequência máxima de varredura de linha de 400 kHz. Da mesma forma, a equipe usou um AOD para obter uma frequência de varredura lenta razoável na outra direção.

Para melhorar ainda mais a adaptabilidade de seu microscópio, a equipe adicionou a opção de mudar para um mecanismo de varredura a laser baseado em galvanômetro quando necessário. Isso permitiu a varredura de grandes regiões da amostra com resolução e velocidade aceitáveis, facilitando a localização de pequenas áreas de interesse antes de mudar para a varredura AOD.

A equipe realizou vários experimentos de prova de conceito com o TPM recém-projetado. Eles instalaram janelas cranianas em camundongos geneticamente modificados e as usaram para observar a morfologia e a atividade dos neurônios, bem como o movimento de glóbulos vermelhos únicos (hemácias). O sistema alcançou uma taxa de quadros de até 10.000 FPS usando uma configuração AOD e tamanho de quadro apropriados. Isso foi suficiente para medir com precisão a velocidade com que o cálcio se propaga nos dendritos neuronais, bem como para visualizar a trajetória de hemácias individuais dentro dos vasos sanguíneos.

Impressionado com esses resultados, o Dr. Na Ji, Editor Associado de Neurofotônica e Luis Alvarez Memorial Chair em Física Experimental na UC Berkeley, comenta: "O novo sistema para microscopia de varredura baseada em AOD representa uma melhoria substancial na velocidade e no desempenho da imagem, conforme demonstrado em sua aplicação para propagação de sinal de cálcio e medições de fluxo sanguíneo no cérebro in vivo."